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2025-09-25T13:16:48Z

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病毒定量是透過計數或計算樣本中的病毒顆粒（virions）數量，以測定病毒濃度。此技術不僅用於學術及商業實驗室的研究與開發（R&D），也應用於生產情境中，因為在生產的各個階段，病毒的數量是必須監控的重要變數。例如，生產病毒疫苗、使用病毒載體製造重組蛋白，以及生產病毒抗原等，都需要進行病毒定量，以持續監控並調整製程，從而優化產品質量與產量，並應對不斷變化的需求和應用。其他需要定量病毒的具體實例包括：克隆篩選、感染複數（MOI）優化，以及將方法應用於細胞培養。

病毒定量方法可透過多種方式分類。在此，我們根據測量標的物及其生物學背景對定量方法進行分類。例如，細胞層級分析法通常測量具感染能力的單位（活性病毒）。其他方法可能測量病毒蛋白、DNA、RNA或分子顆粒的濃度，但不一定能測量其感染力。每種方法各有其優缺點，而這些優缺點往往決定了該方法適用於何種特定應用。

==細胞層級分析法==

===噬菌斑分析法===

噬菌斑分析法是一種常用方法，用以感染劑量來表示病毒濃度。噬菌斑分析法測定病毒樣本中的噬菌斑形成單位（PFU），這是病毒數量的一種度量方式。此分析法基於一種在培養皿或多孔細胞培養盤中進行的微生物學方法。具體而言，將含有不同稀釋度病毒的樣本接種於匯合的單層宿主細胞上，然後用半固體培養基（如瓊脂或羧甲基纖維素）覆蓋，以防止病毒在液體培養基中無差別地擴散。當病毒感染固定細胞單層中的一個細胞後，便會形成病毒噬菌斑。受病毒感染的細胞會裂解，並將感染擴散至鄰近細胞，感染至裂解的循環在此重複發生。這將形成一個由未受感染的完整細胞包圍的受感染裂解細胞區域（病毒噬菌斑）。噬菌斑可用光學顯微鏡觀察，或使用細胞染色技術（例如，用結晶紫溶液染色以區分完整細胞與裂解細胞）進行肉眼觀察。噬菌斑的形成可能需要3至14天，具體取決於所分析的病毒。噬菌斑通常以人工計數，計數結果結合感染液（最初加到細胞上的樣本）的稀釋倍數，用於計算每單位樣本體積的噬菌斑形成單位（PFU/mL）。PFU/mL數值代表樣本中具感染力病毒顆粒的濃度，其計算基於「每個形成的噬菌斑均由單一具感染力的病毒顆粒起始感染所致」的假設。

===焦點形成分析法（FFA）===

焦點形成分析法（FFA）是噬菌斑分析法的一種變體，但FFA並非依賴細胞裂解來檢測噬菌斑的形成，而是採用免疫染色技術，使用針對病毒抗原的螢光標記抗體，在實際噬菌斑形成前偵測受感染的宿主細胞和具感染力的病毒顆粒。對於不裂解細胞膜的病毒類型，FFA特別有用，因為這類病毒不適用於噬菌斑分析法。與噬菌斑分析法一樣，將不同稀釋度的病毒樣本感染宿主細胞單層，並在半固體覆蓋培養基下進行相對短暫的孵育（例如24至72小時），這種培養基能限制具感染力病毒的擴散，從而形成局部的受感染細胞群（焦點）。隨後，用針對病毒抗原的螢光標記抗體對培養盤進行探測，並使用螢光顯微鏡來計數和量化焦點的數量。FFA方法通常比噬菌斑分析法或50%組織培養感染劑量（TCID₅₀）分析法（見下文）更快得出結果，但在所需試劑和設備方面可能成本更高。分析完成時間也取決於使用者計數的區域大小。較大的區域需要更多時間，但能更準確地代表樣本。FFA的結果以每毫升的焦點形成單位（FFU/mL）表示。

===TCID₅₀終點稀釋分析法===
TCID₅₀（50%組織培養感染劑量）分析法是測量具感染力病毒效價的方法。這種終點稀釋分析法用於量化殺死50%受感染宿主或在50%接種的組織培養細胞中產生細胞病變效應所需的病毒量。此分析法在臨床研究應用中可能更為常見，特別是當需要確定病毒的致死劑量，或者病毒不會形成噬菌斑時。在組織培養的應用中，先將宿主細胞鋪盤，然後加入經過連續稀釋的病毒。孵育後，人工觀察並記錄每個病毒稀釋度下的細胞死亡百分比（即受感染細胞），並利用這些結果透過數學計算得出TCID₅₀結果。由於分析方法和原理存在顯著差異，TCID₅₀的結果與pfu/mL或其他感染力分析法的結果並不等同。由於細胞感染需要時間，此方法可能耗時長達一週。

常用於計算TCID₅₀（也可用於計算其他類型的50%終點，如EC50、IC50和LD50）的兩種方法是：
* 斯皮爾曼-卡爾伯法
* 里德-門奇法

根據泊松分佈（一種機率分佈，描述在已知平均速率（病毒效價）下，隨機事件（病毒顆粒）在固定空間（孔中的病毒培養基量）內發生的可能性），TCID₅₀和PFU之間的理論關係約為0.69 PFU = 1 TCID₅₀。然而，必須強調的是，在實踐中，即使是對於相同的病毒與細胞組合，這種關係也可能不成立，因為這兩種分析法的設置方式不同，且病毒的感染力對細胞年齡、覆蓋培養基等多种因素非常敏感。
但以下參考資料對此關係有不同的定義：

摘自ATTC：「假設使用相同的細胞系統，病毒能在這些細胞上形成噬菌斑，且未添加任何會抑制噬菌斑形成的程序，那麼1毫升的病毒原液預計其噬菌斑形成單位（PFU）數量約為TCID₅₀數量的一半。這只是一個估計，其理據在於，能夠感染50%受挑戰細胞層的極限稀釋度，通常預期會在受感染的細胞層中初步產生單一噬菌斑。在某些情況下，可能偶然形成兩個或更多噬菌斑，因此實際的PFU數量應透過實驗確定。

「從數學上看，預期的PFU會略高於TCID₅₀的一半，因為TCID₅₀中的陰性管代表零個噬菌斑形成單位，而陽性管則各代表一個或多個噬菌斑形成單位。應用泊松分佈可以得到更精確的估計。其中，P(0) 為陰性管的比例，m 為每單位體積的平均感染單位數（PFU/ml），則 P(0) = e^-m。對於任何以TCID₅₀表示的效價，P(0) = 0.5。因此，0.5 = e^-m，而 m = -ln(0.5) ≈ 0.7。

「因此，可將TCID₅₀效價（每毫升）乘以0.7，來預測PFU/mL的平均數。在實際應用這些計算時，請記住，計算出的平均值僅在以下情況下有效：為了觀察噬菌斑而對實驗方案所做的更改，與TCID₅₀所用條件相比，不會改變具感染力病毒的表現。

「因此，作為一個工作估計，可以假設TCID₅₀為 1 × 10⁵ TCID₅₀/mL的材料將產生 0.7 × 10⁵ PFU/mL。」

==蛋白質與抗體層級分析法==

蛋白質與抗體層級的病毒定量分析法有多種變體。總體而言，這些方法量化的是樣本中所有蛋白質的總量或某種特定病毒蛋白的量，而非受感染細胞或病毒顆粒的數量。定量通常依賴比色法或螢光偵測。某些分析法變體直接量化樣本中的蛋白質，而其他變體則需要在定量前，先感染宿主細胞並進行孵育以讓病毒生長。使用何種變體主要取決於初始樣本中的蛋白質（即病毒蛋白）含量以及分析法本身的靈敏度。如果需要孵育和病毒生長，通常在分析前會進行細胞及/或病毒的裂解/消化。大多數基於蛋白質的方法相對快速且靈敏，但需要高品質的標準品進行準確校準，並且量化的是蛋白質，而非實際的病毒顆粒濃度。以下是廣泛使用的蛋白質層級分析法的具體範例。

===血球凝集分析法===

血球凝集分析法（HA）是一種常用於流感病毒的非螢光蛋白質定量分析法。它利用流感病毒表面蛋白——血球凝集素能夠凝集紅血球（即導致紅血球聚集）的特性。在此分析中，將流感樣本的稀釋液與1%的紅血球溶液一同孵育一小時，並肉眼觀察首次出現凝集的病毒稀釋度。此分析產生的結果為血球凝集單位（HAU），典型的PFU與HAU比率在10⁶範圍內。此分析約需1至2小時完成。

血球凝集抑制分析法是HA分析法的一種常見變體，用於測量血清中流感特異性抗體的水平。在此變體中，血清中針對流感病毒的抗體會干擾病毒與紅血球的結合。因此，當抗體濃度足夠高時，血球凝集會受到抑制。

===二辛可寧酸（BCA）分析法===

二辛可寧酸分析法（BCA；亦稱史密斯分析法）基於簡單的比色法測量，是一種常用的蛋白質定量分析法。BCA類似於勞里法或布拉德福德蛋白質分析法。BCA分析試劑最初由皮爾斯化學公司（現為賽默飛世爾科技旗下公司）開發並商業化，該公司持有其專利至2006年。

在BCA分析法中，蛋白質的肽鍵定量地將Cu²⁺還原為Cu¹⁺，產生淡藍色。BCA以2:1的比例與Cu¹⁺螯合，形成顏色更深的物質，其在562 nm處有吸收峰。樣品在562 nm的吸光度用於確定樣品中的總蛋白質濃度。分析結果需使用分光光度計或盤式分析儀進行分析後，與已知的標準曲線進行比較。總分析時間為30分鐘至一小時。雖然此分析法普遍且快速，但它缺乏對病毒蛋白的特異性，因為它會計算樣本中的所有蛋白質。因此，待定量的病毒製劑中宿主細胞蛋白的含量必須非常低。

===酵素連結免疫吸附分析法（ELISA）===

酵素連結免疫吸附分析法（ELISA）是一種基於抗體的分析法，它利用與酵素化學鍵結的抗原特異性抗體（或與另一種鍵結酵素的二級抗體結合）來檢測樣本中未知量的抗原（例如病毒蛋白）。抗體-抗原的結合事件是通過酵素將底物試劑轉化為可檢測信號的能力來偵測及/或量化的，該信號隨後可用於計算樣本中目標抗原的濃度。辣根過氧化物酶（HRP）是ELISA方案中常用的酵素，因其能夠放大信號並提高分析靈敏度。

ELISA分析法有多種變體或類型，但通常可分為間接法、競爭法、三明治法或反轉法。

===單向放射免疫擴散（SRID）分析法===
單向放射免疫擴散分析法（SRID），亦稱曼奇尼法，是一種蛋白質分析法，它通過在半固體培養基（如瓊脂）中的免疫擴散來檢測特定病毒抗原的量。培養基中含有對目標抗原具特異性的抗血清，而抗原則被置於圓盤中心。隨著抗原擴散至培養基中，會形成一個沉澱環，該環會持續增長直至達到平衡。分析時間從10小時到數天不等，取決於抗原和抗體的平衡時間。沉澱環的區帶直徑與蛋白質濃度的對數呈線性關係，並與已知蛋白質標準品的區帶直徑進行比較以進行定量。

==DNA與RNA分析法==

===定量聚合酶鏈鎖反應（qPCR）===

定量PCR利用聚合酶鏈鎖反應化學原理來擴增病毒DNA或RNA，使其濃度高到足以透過螢光進行偵測和定量。一般而言，qPCR的定量依賴於將已知濃度的標準品進行連續稀釋，並與未知樣本平行分析，以作為校準和參考。可使用多種螢光偵測策略來實現定量檢測，包括序列專一性探針或非專一性螢光染劑如SYBR綠色染劑。
序列專一性探針，如TaqMan、分子信標（Molecular Beacons）或蠍形探針（Scorpion），僅與反應過程中產生的特定序列DNA結合。SYBR綠色染劑則與反應中產生的所有雙股DNA結合。

雖然SYBR綠色染劑使用方便，但其缺乏特異性和較低的靈敏度，使得大多數實驗室傾向於使用基於探針的qPCR偵測方案。qPCR有多種變體，包括比較閾值法，該方法通過比較多個樣本（包含內部標準品）的Ct值（產物量出現統計學上顯著增加的PCR循環數）來進行相對定量。

PCR會擴增所有目標核酸，包括來自完整具感染力病毒顆粒的、來自有缺陷病毒顆粒的，以及溶液中游離的核酸。因此，qPCR的結果（以基因組拷бе數/mL表示）在數量上可能高於TEM的結果。對於病毒定量，完整病毒粒子與核酸拷貝數的比例很少是1:1。這是因為在病毒複製過程中，核酸和病毒蛋白的產生比例並非總是1:1，且病毒組裝過程會產生完整的病毒粒子以及空的衣殼及/或過量的游離病毒基因組。以口蹄疫病毒為例，在活躍複製的宿主細胞內，完整病毒粒子與RNA拷貝數的比例約為1:1000。qPCR滴定的優點包括周轉時間快（1-4小時）和靈敏度高（可檢測到比其他方法低得多的病毒濃度）。

==顆粒分析法==
===可調電阻脈衝感測（TRPS）===

可調電阻脈衝感測（TRPS）是一種方法，能夠對單個病毒顆粒進行高通量的單顆粒測量，即讓病毒顆粒逐一通過一個尺寸可調的奈米孔。該技術的優點是能夠同時以高解析度測定溶液中病毒顆粒的大小和濃度。這可用於評估樣本的穩定性和聚集體的貢獻，以及總病毒顆粒濃度（vp/mL）。

基於TRPS的測量在離子緩衝液中進行，分析前無需對樣本進行預染色，因此該技術比需要用螢光染劑進行預處理的技術更為快速，每個樣本的總製備和測量時間不到10分鐘。基於TRPS的病毒分析可透過qViro-X系統商業化獲得，該系統具有在測量後進行化學或高壓滅菌去汙的能力。

===單一病毒感應耦合電漿質譜法（SV ICP-MS）===

此技術類似於由Degueldre和Favarger（2003）發現並隨後應用於其他奈米顆粒（例如金膠體，見Degueldre等人（2006））的單顆粒感應耦合電漿質譜法（SP ICP-MS）。在一項綜合研究中（Degueldre，2021），SP ICP-MS被改編用於單一病毒感應耦合電漿質譜法（SV ICPMS）的分析。該研究建議將此方法用於單一病毒（SV）的鑑定與計數。利用高解析度多通道扇形磁場（MC SF）ICP-MS在SV偵測模式下的記錄，對主要與關鍵離子的計數可以實現單一病毒的分析與鑑定。在20秒內可以完成2-500個病毒單位的計數。建議在氬氣炬中進行主要離子（12C+、13C+、14N+、15N+）和關鍵離子（31P+、32S+、33S+和34S+）的分析。所有干擾因素都進行了詳細討論。建議使用高解析度MC ICP-MS，同時也探討了在厭氧/好氧氣氛下的選項，以在使用四極桿ICP-MS時提升分析效果。研究中探討了此方法在兩種病毒類型（SARS-COV2和T5噬菌體）上的應用，透過對選定病毒離子的時間掃描和固定質量分析，利用N/C、P/C和S/C的莫耳比來表徵物種並量化其數量濃度。

==其他分析法==

===流式細胞儀===

雖然大多數流式細胞儀的靈敏度不足，但市面上已有少數幾款流式細胞儀可用於病毒定量。病毒計數器利用螢光來偵測共域的蛋白質與核酸，從而量化樣本中完整病毒顆粒的數量。樣本用兩種染劑染色，一種專門針對蛋白質，另一種專門針對核酸，然後在樣本流經雷射光束時進行分析。通過確定在兩個不同螢光通道上同時產生事件的顆粒數量，並結合測得的樣本流速，來計算病毒顆粒的濃度（vp/mL）。其絕對數量結果通常與TEM的結果相似。該分析法的線性工作範圍為10⁵–10⁹ vp/mL，分析時間約為10分鐘，樣本製備時間短。

===穿透式電子顯微鏡（TEM）===

TEM是一種特殊的顯微鏡技術，它利用由磁場聚焦的電子束對樣本進行成像。TEM提供的空間解析度比光學顯微鏡高1000倍（解析度可達0.2 nm）。需要使用超薄且經過負染色的樣本。樣本製備包括將標本沉積在有塗層的TEM網格上，並用電子不透明液體進行負染色。如果將組織包埋的樣本切成薄片，也可以進行檢查。樣本製備因實驗方案和操作者而異，但通常需要數小時才能完成。TEM影像可以顯示單個病毒顆粒，並可利用定量影像分析來確定病毒濃度。這些高解析度影像還能提供大多數其他方法無法提供的顆粒形態資訊。定量的TEM結果通常會高於其他分析法的結果，因為它量化了所有顆粒，不論其是否具有感染力，報告結果為每毫升的類病毒顆粒（vlp/mL）。定量TEM通常適用於病毒濃度高於10⁶ 顆粒/mL的情況。由於儀器成本高昂，且需要大量空間和配套設施，TEM設備僅在少數實驗室中可用。

== 參見 ==
* 亞病毒因子列表
* 最小感染劑量
* 病毒量

== 參考資料 ==

== 延伸閱讀 ==

Category:實驗室技術
Category:免疫學
Category:病毒學

[[分類: 待校正]]

病毒定量 - 修訂紀錄

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